利用 AOTF 近紅外光譜儀檢測中藥中微生物的方法

摘?? 要??? 本文采用 AOTF 近紅外光譜技術(shù)以漫反射方式對新癀片中的微生物即細菌和霉菌進 行光譜掃描，分別建立了偏最小二乘法（PLS1）回歸模型和主成分分析模型。通過偏最小二 乘法（PLS1），建立了菌體數(shù)量的回歸模型，并探討了菌體數(shù)量梯度對模型預(yù)測結(jié)果的影響， 最終確定了以多模型分步快速菌檢法的預(yù)測方法。通過主成分分析模型，結(jié)果顯示 AOTF 技 術(shù)建立的數(shù)學(xué)模型不僅能夠分辨出樣品中的菌體數(shù)量是否合格，還能夠?qū)w是否具有活性 進行定性。實驗結(jié)果表明，AOTF-NIR Luminar 5030 光譜儀利用使用光譜數(shù)據(jù)和校準(zhǔn)模型， 能夠快速準(zhǔn)確地對新癀片中的菌體進行定量分析和定性分析。

主題詞?? 聲光可調(diào)濾光器；近紅外光譜；微生物；偏最小二乘法（PLS1）

在中藥制藥行業(yè)，對細菌等微生物的的檢測按照國家藥典的規(guī)定是必須進行的一項檢測 項目，常規(guī)的檢測方法是利用培養(yǎng)基培養(yǎng)計數(shù)的方式來進行檢測[1]，該方法操作復(fù)雜、費時 費力，至少需要 48 小時才能得到最終的檢測結(jié)果，不能夠保持一個流暢的生產(chǎn)過程。如何 尋找一種快速的檢測方式，能夠迅速得到檢驗結(jié)果，對中藥制藥行業(yè)的生產(chǎn)具有重大的意義。 近幾年在中國興起的近紅外檢測技術(shù)，作為一門獨立的分析檢測技術(shù)具有不需要樣品的預(yù)處 理，檢測速度快（秒級速度），不消耗試劑、綠色環(huán)保分析等特點，符合菌檢快速檢測的要 求，但是，能否利用近紅外技術(shù)對細菌等微生物進行檢測，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度如何？以往從 未見此方面的論文或報道。鑒于此，我們利用美國 Brimrose 公司的 Luminar 5030 型便攜式 AOTF 技術(shù)近紅外光譜儀對廈門中藥廠有限公司提供的 20 個樣品進行光譜采集，建立模型并 預(yù)測，以考察 AOTF-NIR 技術(shù)能否在菌檢項目中成功應(yīng)用。聲光可調(diào)濾光器（Acousto-optic tunable filter，簡稱 AOTF）是基于各向異性的雙折射晶體的聲光衍射原理，利用超聲波 與特定的晶體作用而產(chǎn)生分光的光電器件[2,3,4]。與傳統(tǒng)的基于機械調(diào)諧分光元件的光譜儀器 相比，以 AOTF 作為分光元件的光譜儀具有明顯的優(yōu)越性：它結(jié)構(gòu)簡單，光學(xué)系統(tǒng)無移動性 部件，體積小，集光能力強，最吸引人之處在于它的掃描速度快、信噪比高[5]。

1. 實驗部分

1.1 ?儀器條件和樣品處理

儀器：美國 BRIMROSE 公司產(chǎn)的 Luminar 5030 型便攜式 AOTF 技術(shù)近紅外光譜儀，主要 部件包括：光學(xué)部分、控制部分、電源適配器、筆記本電腦。儀器波長范圍為 1100nm 到 2300nm， 2nm 的波長增量，掃描次數(shù)為 300，采用 InGaAs 檢測器。挪威 CAMO 公司 The Unscrambler 分析軟件。

樣品：新癀片不規(guī)則顆粒狀樣品 20 個，編號為 1-20，其中 1 號和 2 號樣品中的微生物 已經(jīng)殺死，為死菌體；3-20 號樣品中的微生物為活菌體。并提供每個樣品細菌數(shù)和霉菌數(shù) 的數(shù)據(jù)，單位為：個/克。見表 1 所示。

表 1: 樣品的編號及微生物個數(shù)值

1.2 實驗方法：?

本次實驗掃描新癀片樣品數(shù)量 20 個，樣品狀態(tài)為不規(guī)則的顆粒狀。使用美國 Brimrose 公司 Luminar 5030 型近紅外光譜儀采集樣品的光譜數(shù)據(jù)。將樣品放置于樣品盒的槽中，用 盒蓋將樣品刮平，連同盒蓋一起放置于支架上，光譜儀的探頭卡在樣品盒蓋的圓孔中，垂直 卡緊，采用漫反射的測樣方式采集光譜。每一張光譜都是 300 次掃描的平均結(jié)果。波長范圍 從 1100nm 到 2300nm，波長增量為 2nm。每個樣品均連續(xù)掃描 5 張光譜，共得到 100 張光譜。 將 100 個光譜數(shù)據(jù)經(jīng)過一階微分處理（9 點平滑），導(dǎo)入 The Unscrambler 分析軟件，然后 利用 PCA 對光譜數(shù)據(jù)進行計算創(chuàng)建定性校正模型；將細菌數(shù)和霉菌數(shù)的數(shù)據(jù)與樣品一一對 應(yīng)，采用 PLS1 方式進行計算建立定量校正模型。

1.3 光譜及預(yù)處理

?新癀片樣品的原始吸收光譜（見圖 5），從圖中可以看出，所有光譜排列整齊有序，沒 有異常的樣品光譜。新癀片樣品的一階微分光譜（見圖 6），同樣整齊有序，有比較明顯的 吸收峰，光譜排列更加緊密，光譜與光譜之間的相似性較強，采集到的光譜信息量大。

2．建立 PLS1 定量分析模型

2.1 模型的建立

表 1 為所提供樣品的編號及每個樣品所對應(yīng)的細菌數(shù)和霉菌數(shù)的數(shù)據(jù)。在 The Unscrambler 軟件中，將每個樣品的光譜數(shù)據(jù)與細菌和霉菌個數(shù)的數(shù)據(jù)一一對應(yīng)，如圖 3 所 示。

采用偏最小二乘法（PLS1），完全交互驗證（Full Cross Validation）的方式建立細 菌和霉菌的回歸定量分析模型。

2.2 結(jié)果分析

從圖 4 圖 5 的細菌和霉菌的回歸模型看：兩者都有很好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為 0.9791 和 0.9895。因此，我們可以初步判斷利用近紅外光譜可以得到微生物有效的信息。 因為建立模型所用的樣品數(shù)量比較少，無法進行未知樣品的驗證，因此，我們用所建 立的模型對所有掃描的光譜進行一個內(nèi)部的驗證，所得到的結(jié)果與外部驗證相似，可以說明

相同的問題。表 2 是調(diào)用模型對細菌和霉菌的一個驗證結(jié)果：

表 2.模型對細菌和霉菌的預(yù)測結(jié)果

從表 2 可以看出：細菌數(shù)量大于 300 個的樣品和霉菌數(shù)量大于 600 個的樣品的模型預(yù) 測結(jié)果都接近于實際值，比較準(zhǔn)確。但是對數(shù)量比較少的樣品預(yù)測的結(jié)果差別非常大。這是 因為兩個模型的數(shù)據(jù)梯度非常大，數(shù)據(jù)從幾個到幾千，在這么寬的數(shù)據(jù)范圍內(nèi)，由于樣品量 有限，沒有很好的梯度間隔，而且，微生物個數(shù)少的樣品其信號反應(yīng)也相對較弱，因此，很 難預(yù)測其準(zhǔn)確的個數(shù)。

2.3 模型的改進

針對細菌而言，如果我們的最終結(jié)果只是要求將細菌的個數(shù)控制一個數(shù)量之下，

比如少于 7000 個為合格，那么以上模型雖然對細菌少的樣品預(yù)測不夠準(zhǔn)確，但能夠達到控

制的要求。對于霉菌來說，國家標(biāo)準(zhǔn)要求是少于 100 個為合格，那么我們換一個思路，用霉

菌數(shù)量少于等于 100 個的樣品建立霉菌的模型，看能夠達到什么樣的預(yù)測效果。在掃描的 100 個光譜中，霉菌數(shù)量 100 個以下的樣品的光譜個數(shù)共為 55 個。利用這 55 個光譜數(shù)據(jù)和 對應(yīng)的霉菌個數(shù)值，建立 100 個以下霉菌的模型，見圖 6。

從圖 6 可以看出，霉菌小范圍模型有更好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)達到了 0.9913,利用這個

模型對建模用的 55 個光譜進行預(yù)測，得到表 3 的結(jié)果。

表 3.霉菌 100 以下小范圍模型預(yù)測結(jié)果與實際值的比較

從表 3 可以看出：霉菌的 100 以下小范圍模型對 100 個以下的樣品預(yù)測的結(jié)果準(zhǔn)確度非 常高，只有正負(fù)幾個的絕對偏差。小范圍模型預(yù)測霉菌數(shù)量少的樣品比較準(zhǔn)確，那么預(yù)測霉 菌數(shù)量大于 100 個的樣品的結(jié)果會怎么樣？表 4 是霉菌數(shù)量大于 100 的樣品的預(yù)測結(jié)果。

表 4.小范圍模型預(yù)測霉菌數(shù)量大于 100 的樣品的結(jié)果

從表 4 可以看出：霉菌數(shù)量小于 100 的樣品所建立的小范圍測試模型預(yù)測霉菌數(shù)量大 于 100 的樣品的結(jié)果與實際值相差很大，這是正常的，因為所測試的樣品范圍不在建模范圍 之內(nèi)，預(yù)測的結(jié)果肯定是不準(zhǔn)確的。我們可以嘗試用霉菌的數(shù)量小于 600 個的所有樣品再建 立一個模型。在掃描的 100 個光譜中，霉菌數(shù)量小于 600 個的樣品的光譜個數(shù)共為 75 個。 利用這 75 個光譜數(shù)據(jù)和對應(yīng)的霉菌個數(shù)值，建立 600 個以下霉菌的模型，見圖 7。

從圖 7 可以看出，霉菌 600 個以下的模型也有很好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為 0.9823,利用

這個模型對建模用的 75 個光譜進行預(yù)測，得到表 5 的結(jié)果。

表 5.霉菌 600 個以下的模型預(yù)測霉菌數(shù)量小于 600 個的樣品的結(jié)果

從表 5 可以看出：霉菌 600 個以下的模型對霉菌數(shù)量為 170、200、250、600 個的四個 樣品預(yù)測的結(jié)果準(zhǔn)確度很高；對霉菌數(shù)量 100 個以下的樣品預(yù)測準(zhǔn)確度降低，但每個樣品的 平均值仍然能夠接近于實際值。

2.4 綜合解決方案

綜合以上的分析，在如此大的數(shù)據(jù)梯度范圍內(nèi)，我們沒有辦法只用一個模型就能夠測 量準(zhǔn)確所有的樣品。但是，分析本次實驗我們可以發(fā)現(xiàn)建立三個模型就可以準(zhǔn)確預(yù)測每一個 樣品的霉菌數(shù)量（細菌與此類似，不再作詳細分析），這三個模型是：所有樣品參與建立的 寬數(shù)據(jù)范圍的綜合模型，我們不妨稱其為 model-all；霉菌數(shù)量小于 600 個樣品建立的模型 稱為 model-1000；霉菌數(shù)量小于 100 個樣品建立的小范圍模型稱為 model-100。

分析表 2，霉菌個數(shù)在 1000 個以上的樣品預(yù)測的非常準(zhǔn)確，個數(shù)在 1000 個以下的樣品 預(yù)測值沒有超過 1000 的，因此，通過 model-all 的預(yù)測，可以有效地將霉菌個數(shù)在 1000 個 以上的樣品進行準(zhǔn)確檢測。

分析表 5，利用 model-1000 模型，可以準(zhǔn)確預(yù)測霉菌數(shù)量 100 個以上的樣品。霉菌數(shù) 量 100 個以下的樣品預(yù)測不夠準(zhǔn)確。

分析表 3，利用 model-100 模型，對霉菌數(shù)量在 100 個以下的樣品預(yù)測的準(zhǔn)確度非常高。

根據(jù)以上分析總結(jié)，完全可以利用 AOTF-NIR 技術(shù)，實現(xiàn)快速菌檢的工作。步驟如下： 掃描未知樣品的光譜，首先用 model-all 模型進行預(yù)測，預(yù)測值大于 1000，那么，該樣品 的霉菌數(shù)量即為該數(shù)值；如果樣品的預(yù)測值小于 1000，用 model-1000 模型再對該樣品的光 譜進行預(yù)測，如果預(yù)測值在 200-1000 范圍之內(nèi)，那么我們可以肯定該樣品的預(yù)測值為該樣

品的真實值，如果預(yù)測值在 100-200 范圍內(nèi)，那么我們需要對該樣品重復(fù)掃描 5 次，用 model-1000 模型預(yù)測 5 次光譜的平均值，即為該樣品的真實值；如果用 model-1000 模型預(yù) 測該樣品光譜的預(yù)測值小于 100，那么，再調(diào)用 model-100 模型對該樣品進行準(zhǔn)確的預(yù)測， 得到的結(jié)果就是該樣品的實際值。

3．分析菌體數(shù)量是否合格

3.1 定性模型的建立

多模型分步快速菌檢法非常適合 AOTF-NIR 技術(shù)在實驗室快速對藥品中的微生物進行檢 測，但是，該方法相對復(fù)雜，不能夠適應(yīng)在線的快速微生物檢測，下面我們來探討一下用定 性分析的方法，能否解決在線菌檢的工作。

還是以霉菌為例。定性分析和定量分析是兩個不同的概念，定量分析可以檢測到一個 樣品中含有的霉菌的具體個數(shù)；定性分析是判斷是與否的問題，假設(shè)規(guī)定藥品中含有霉菌的 個數(shù)超過 100 個為不合格，少于 100 個為合格品，那么定性分析就是判斷所檢測的藥品是否 合格的問題。

在已有的 20 個樣品中，11 個樣品的霉菌個數(shù)不超過 100，9 個樣品的霉菌個數(shù)在 100 個以上。利用主成分分析（PCA）對 11 個樣品的一階微分光譜數(shù)據(jù)進行聚類，作為合格樣品 集；對 9 個樣品的一階微分光譜數(shù)據(jù)進行聚類，作為不合格樣品集。因為每個樣品我們掃描 了 5 張光譜，我們可以將每個樣品的第一張光譜分出來，作為驗證用，其余的 4 個光譜參與 建立定性分析的模型。這樣，合格樣品集有 11 張驗證光譜，不合格樣品集有 9 張驗證光譜。 44 張合格品光譜建立的定性模型為 yes，36 個不合格品樣品建立的定性模型為 no，見圖 8 和圖 9。